ローズマリーの持つ他感物質による発芽生育阻害作用の検討

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目次

1.序論... 1

2.目的... 2

3.材料と方法... 3

3-1.試料... 3

3-2測定方法... 3

3-3抽出方法... 3

3-4発芽生育試験... 3

3-4-1.DW抽出液を用いた実験方法... 3

3-4-2.メタノール抽出液を用いた実験方法... 3

3-5.主要成分分析... 4

4.結果... 5

4-1.各部位のDW抽出液によるコマツナ・アルファルファ・レタスの発芽生育試験結果... 6

4-1-1.各部位の10wt%DW抽出液による発芽生育試験結果... 7

4-1-2.各部位の5%wtDW抽出液による発芽生育試験結果... 10

4-2.各部位のMtOH抽出液によるコマツナ・アルファルファ・レタスの発芽生育試験結果... 13

4-2-1. 各部位の10wt%MtOH抽出液による発芽生育試験結果... 14

4-2-2.各部位の5wt%MtOH抽出液による発芽生育試験結果... 17

4-3.葉のMtOH抽出液による発芽生育試験結果... 20

4-4.外見上の変化... 28

4-5.主要成分分析結果... 31

4-5-1.分画した各成分による発芽試験結果... 31

4-5-2.有効区画のGC-MS分析結果... 32

5.考察... 34

5-1.各部位のDW抽出液によるコマツナ、アルファルファ、レタスの発芽生育試験への考察    34

5-2.各部位のMtOH抽出液によるコマツナ、アルファルファ、レタスの発芽生育試験への考察    35

5-3. 葉のMtOH抽出液による発芽生育試験の考察... 36

5-4. 外見上の変化に対する考察... 37

5-5. 主要成分分析結果... 38

6.参考文献... 39

7.謝辞... 40

1.序論

 植物に含まれる二次代謝物は、長年薬効成分として広く利用されてきたが、近年、その植物が本来有する機能としての利用が研究されている。そのひとつが他感作用であり、特に除草作用や土壌回復作用についての研究が盛んである。この作用は古くから観察されており、今から紀元前3世紀前ではギリシャの哲学者テオフラストスの著「植物誌」の中に「ヒヨコマメ(Cicer arietum)は土壌を疲れさせ、雑草とくにハマビシ(Tribulus terrestris)を枯らす」と記述している。このようにこの作用は古くから先人達が観察してきているのである。
 他感作用とは「植物が放出する化学物質により、他の生物に対して何らかの作用を及ぼす現象」と定義されている作用である。作用経路として、葉などの地上部から揮発物質として放出される揮散、生葉あるいは植物体の落ち葉、落ち枝などから雨によって出される溶脱、根など地下部から染み出る滲出などが分かっている。
 農業生産において植物の生育阻害や連作障害、また、コンパニオンプランツとして植物が互いに成長の良い影響を与え合うことなどが知られている。阻害作用の例として、外来種であるセイタカアワダチソウは地下茎から他感物質であるcis-dehydromatricaria esterを放出することで他の植物の生育を抑制し、また、サルビアは自身の周囲を裸地とするサルビア現象と呼ばれる作用を持つことが挙げられる。

2.目的

 ローズマリー(Rosmarinus officinalis)は、上記のサルビア現象と酷似した除草能力が確認されており、他感作用によるものだと考えられている。現在、農薬等の過剰使用の反省から、有機農法の見直しが進んでおり、農薬を用いない除草方法は大きな課題のひとつである。そこで、有機農法における雑草除去法の一つとして、ローズマリーが持つ他感作用に着目し、その効果と利用について検討を行った。

3.材料と方法

3-1.試料

試料としたローズマリーは、埼玉県立いずみ高等学校の農場で栽培され、自然乾燥されたものを用いた。実験には葉、茎、根の各部位を用いた。また、発芽生育試験には以下の種子を用いた。

3-2測定方法

 種子の表皮が破れた段階で発芽とみなし、発芽後は全長を測定した。

3-3抽出方法

 試料をミキサーで粉砕し、試料濃度が10wt%となるよう水またはエタノールを加え、混合後一時間静置した。その後、濾紙を用いてろ過したものを原液とし、各濃度に希釈して用いた。今回の実験では、それぞれ1%、2.5%、5%、10%になるよう調製した。

3-4発芽生育試験

 今回の研究では、抽出溶液の違いを理由に、以下の2つの方法を用いた。抽出方法は3-3に準じた。

3-4-1.DW抽出液を用いた実験方法

 直径38mmの6穴プレートに発芽床として濾紙を設置し、各抽出液を0.7mL加え、各種子を10粒ずつ設置した。暗黒下、室温で保管し、1日目、2日目、7日目に観察及び測定を行った。

3-4-2.メタノール抽出液を用いた実験方法

 直径38mmの6穴プレートに発芽床として濾紙を設置し、各抽出液を0.7mL加え、60℃で1時間乾燥機に入れ乾燥させた。その後、水0.7mL加え、各種子を10粒ずつ設置した。暗黒下、室温で保管し、1日目、2日目、7日目に観察及び測定を行った。

3-5.主要成分分析

 縦10cm、横5cmに裁断したろ紙に抽出液をスポットし、ヘキサン:酢酸エチル=7:3の割合で混合した展開溶媒を用いて8cm展開した。展開後、自然乾燥させ、rf値25で区切り4等分し、メタノール5mlを用いて成分を抽出した。抽出した各成分を用いて3-4-2の実験を行い、優位な差が表れた区画の成分を、GC-MSを用いて分析した。分析時の条件は注入口温度300℃、検出温度300℃、開始温度110℃、昇温速度5℃/min、終了温度250℃で行った。

4.結果

 経過ごとの生育推移と発芽率、並びに最終日における種子の最終発芽率(A)、生育量(R)及びその分散である発芽生育指数(C)の三項目を基準とし、各抽出液における阻害作用の評価を行った。各指数は、同条件の対照を分母とした比で表した。また、経過日数ごとにおける各種子の生育推移及び発芽率を表にまとめた。発芽の定義は幼根が表皮を破った段階とし、2日目と7日目で変化が見られない種子は発芽失敗とみなし除外した。

4-1.各部位のDW抽出液によるコマツナ・アルファルファ・レタスの発芽生育試験結果

 3-4-1の方法を用いた根、茎、葉の各部位のD.W抽出液による生育推移と発芽率を以下のグラフと表にまとめた。
 まず、10wt%DW抽出液による結果では、コマツナ、アルファルファ、レタスそれぞれの生育推移はFig.1、Fig.2、Fig.3に、生育評価はそれぞれTable1、Table3、Table5に、発芽率はそれぞれTable2、Table4、Table6に示した。
 次に、5wt%DW抽出液による結果では、コマツナ、アルファルファ、レタスそれぞれの生育推移はFig.4、Fig.5、Fig.6に、生育評価はそれぞれTable7、Table9、Table11に、発芽率はそれぞれTable8、Table10、Table12に示した。

 

4-2.各部位のMtOH抽出液によるコマツナ・アルファルファ・レタスの発芽生育試験結果

 3-4-2の方法を用いた根、茎、葉の各部位のMtOH抽出液による生育推移と発芽率を以下のグラフと表に示した。
 10wt%MtOH抽出液による結果では、コマツナ、アルファルファ、レタスそれぞれの生育推移はFig.7、Fig.8、Fig.9に、生育評価はそれぞれTable13、Table15、Table17に、発芽率はそれぞれTable14、Table16、Table18に示した。
 DW抽出液と比べたとき、特に目に付くのが葉の抽出液による生育量Rの違いである。どの種子においても大きく生育を抑制しており、10wt%DW抽出液の結果と比較した場合、コマツナで約6倍、アルファルファで約3倍、レタスでは約8倍もの差が見られた。発芽率に関してはややDWに劣る結果となったが、生育抑制の効果が大きく、発芽生育指数CにおいてはMtOH抽出の方が優位な差を示した。
 次に、5wt%MtOH抽出液による結果では、コマツナ、アルファルファ、レタスそれぞれの生育推移はFig.10、Fig.11、Fig.12に、生育評価はそれぞれTable19、Table21、Table23に、発芽率はそれぞれTable20、Table22、Table24に示した通りである。
 5wt%濃度となると効果の違いは更に明らかになり、DWでは最終日に殆ど消失したと思われる生育抑制作用も、コマツナ、アルファルファ、レタスそれぞれで27.9、33.6、17.4と10wt%DW抽出液よりも高い水準で維持した結果となった。
 一方で、茎と根の抽出液では5wt%、10wt%ともに対照と優位な差は殆ど表れず、葉の抽出液との差が浮き彫りとなった。
 以上のDW及びMtOHを用いた各部位の抽出液による発芽生育試験の結果を踏まえ、他感物質が含まれているのは葉の部分である可能性が濃厚となり、以後の実験は葉の抽出液を主体とし進めていくことを決定した。

4-3.葉のMtOH抽出液による発芽生育試験結果

 3-4-2の方法を用いた葉のMtOH抽出液による生育推移と発芽率を以下のグラフと表に示す。溶液濃度は自然界での濃度に近いと思われる2.5wt%抽出液とこれまでの実験との比較のため5%抽出液を用いた。
 各濃度の葉の抽出液におけるコマツナの生育推移はFig.13、生育評価をTable25、発芽率をTable26に示したとおりである。同様に、アルファルファの生育推移はFig.14、生育評価をTable27、発芽率をTable28に、レタスの生育推移はFig.15、生育評価をTable29、発芽率をTable30に、ホワイトクローバーの生育推移はFig.16、生育評価をTable31、発芽率をTable32に、ミニトマトの生育推移はFig.17、生育評価をTable33、発芽率をTable34に、ニンジンの生育推移はFig.18、生育評価をTable35、発芽率をTable36に、バジルの生育推移はFig.19、生育評価をTable37、発芽率をTable38に示した。

4-4.外見上の変化

 これまでは最終発芽率Aと生育量R、そして生育指数Cの三種類、即ち数値上の変化について述べてきた。ここでは、発芽及び生育阻害に伴う外見上の変化について記述する。最も変化がわかりやすかったコマツナを例に、各濃度のMtOH抽出液を用い七日目に観察を行った種子の画像を比較する。Fig.20に1wt%、Fig.21に2.5wt%、Fig.22に5wt%、Fig.23に10wt%MtOH抽出液を用いたコマツナの状態を示した。

4-5.主要成分分析結果

4-5-1.分画した各成分による発芽試験結果

 ペーパークロマトグラフィーにより抽出液を展開したろ紙を4等分にし、それぞれからメタノールによって抽出した抽出液によるレタスの発芽試験の結果である(Fig.24)。区画1から4までのうち、95%信頼区間において対照に対し優位な差を示した区画4の抽出液を用いて4-4-2.のGC-MSによる分析を行った。

4-5-2.有効区画のGC-MS分析結果

 Fig.25は3-4-1で優位な差を示した区画4の抽出液をGCで分析したグラフである。ベースラインに乱れが見られるが、いくつかの成分が含まれていることが読み取れる。その中で最も高いピークを示している7.761における成分のMS結果がFig.26上部である。データベースとの照合により、この物質は下部で示されたベルベノンのピークと96%の一致していることがわかった。

5.考察

5-1.各部位のDW抽出液によるコマツナ、アルファルファ、レタスの発芽生育試験への考察

 生育推移を示す各Figを見ると、葉と茎の抽出液では、生育量、発芽率共に試験期間中継続して効果を発揮していることが読み取れた。特にレタスにおいてそれが顕著であり、非常に大きいな影響を受けている事が分かった。一方で、アルファルファは生育量では効果が見られるも、発芽率では殆ど影響を受けていないことが分かった。発芽に対する作用が強く、コマツナ、レタスの1日目における発芽率は0%に抑えられている。また、生育量もコマツナが62.1、アルファルファが67.8、レタスが24.3と対照と比べ優位な差を示している。一方で、茎はやや効果を示したものの、根の抽出液はその殆どが優位な差が表れず、対照とほぼ変わらぬ値を示した。唯一レタスのみ生育量において効果が見られた。
 5wt%濃度になると、発芽・生育両面での抑制が薄れ、特に7日目における効果の減衰が著しい。特に、コマツナにおけるそれが顕著であり、どの部位の抽出液も対照とほぼ変わらないか、茎の抽出液では7日目には118%と促進とも思われる生育を示すほどであった。アルファルファに対する根の抽出液はやや優位な差を示す数値となっているが、これは一部の幼根が腐敗していたことに由来し、腐敗の原因が抽出液によるものなのかどうかは未検証であるため、留意する必要がある。レタスに対しては10wt%、5wt%どちらの濃度でも高い効果が表れており、低濃度における検証を行う際に参考となる結果を得られ生育推移を見る限り、2日目まではある程度の抑制作用が現れており、その間の推移については今後の検証を待ちたい。
 合わせて見ると、10wt%、5wt%どちらの濃度でも、発芽生育指数Cにおいて三種の種子全てで葉の抽出液が最も優位な差を示している。また、10wt%抽出液においては、発芽、生育どちらにおいてもDW抽出液中で最も効果を表している。

5-2.各部位のMtOH抽出液によるコマツナ、アルファルファ、レタスの発芽生育試験への考察

 MtOH抽出液とDW抽出液による結果を比べたとき、特に目に付くのが葉の抽出液による生育量Rの違いである。どの種子においても大きく生育を抑制しており、10wt%DW抽出液の結果と比較した場合、コマツナで約6倍、アルファルファで約3倍、レタスでは約8倍もの差が見られた。発芽率に関してはややDWに劣る結果となったが、生育抑制の効果が大きく、発芽生育指数CにおいてはMtOH抽出の方が優位な差を示した。
 5wt%濃度となると効果の違いは更に明らかになり、DWでは最終日に殆ど消失したと思われる生育抑制作用も、コマツナ、アルファルファ、レタスそれぞれで27.9、33.6、17.4と10wt%DW抽出液よりも高い水準で維持した結果となった。
 一方で、茎と根の抽出液では5wt%、10wt%ともに対照と優位な差は殆ど表れず、葉の抽出液との差が浮き彫りとなった。
 以上のDW及びMtOHを用いた各部位の抽出液による発芽生育試験の結果を踏まえ、他感物質が含まれているのは葉の部分である可能性が濃厚となり、以後の実験は葉の抽出液を主体とし進めていくことを決定した。

5-3. 葉のMtOH抽出液による発芽生育試験の考察

 各種子いずれも効果が現れており、完全な発芽抑制作用は見られないものの、アルファルファとバジルを除いた5種では発芽開始までの遅延が見られた。また、生育量に関しても5wt%濃度では全種子において対照の40%以下の生育量となっており、明らかに有意な差を示している。2.5wt%においても、コマツナ、アルファルファ、レタスの3種は10wt%DW抽出液と比べても有意な差を示しており、生育阻害に関してMtOHが抽出溶液として優れていることが分かった。その他の種子も対照と比較してそれぞれ有意な差を示した。また、これらの濃度変化と生育量の変化は、切片が原点を通らないことから、ある一定の濃度から生育に急激な差が生じる境界値のような地点があるのではないかと予想された。
 同科であるアルファルファとホワイトクローバーは最終発芽率、生育量、生育指数の三点において近い値を示し、同じくローズマリーと同じシソ科のバジルは今回検定に用いた7種の中で最も影響を受けにくい結果を示した。この結果から、他感物質の有効度は科の違いによって大まかな区分が出来るのではないかと考えられる。有効範囲の特定は、除草剤として用いるに当たって非常に重要な部分であるため、詳細な検討を行いたい。

5-4. 外見上の変化に対する考察

 Fig.20では幼根と胚軸の結合部にやや捻れが見受けられる程度で、外見上大きな変化は見られない。Fig.21になると、Fig.20と比べ幼根が短くなっており、やや茶褐色に変色し始めていることが見て取れる。Fig.22になると、明らかな捻れ、幼根及び胚軸の生育不良、全体が褐色へ変色しているなど、明確な差が観察できるようになっている。Fig.23となると、幼根の生育は一切観察できず、変色は子葉にまで及んでおり、捻れが観察できるほどの長さにも達していないことが分かる。
 これらの濃度別による外見上における変化の推移を観察していくと、ローズマリーに含まれる多感物質は、植物の成長を阻害することにより、その目的を達しているのではないかと推測できる。特に、根の発達が著しく阻害されており、新たな種子が根付かないような仕組みになっていると考えられる。既に成長した植物に対してどのような作用を及ぼすか調査することを課題の一つとしたい。

5-5. 主要成分分析結果

区画1から4までのうち、95%信頼区間において優位な差を示したのは区画4のみであったため、有効成分は区画4に含まれていると考えられる。また、DW抽出液とMtOH抽出液間の結果の違いや、セルロースを用いた今回のクロマトグラフィーの結果から有効成分は低極性分子であると推測され、分析結果ではやはり低極性分子であるベルベノンが主要成分として検出された。ベルベノンはローズマリーの主成分の一つであり、現在は香料や駆虫剤として用いられている物質である。人体への毒性は軽微であり、妊婦や乳幼児は避けるべきとされているが、健康な成人に対し悪影響を及ぼすことはほぼないとされている。他の成分は、ピークが小さく、データベースとの照合率も低かったため、特定することは困難であった。今後は精製などによって各成分を単離し、それぞれの分析精度を高めていくことを目指したい。
また、実験の目的外ではあるが、Fig.24における区画4以外の区画1~3における結果を見ると、どれも対照より多い生育量を示していた。抽出液に含まれる成分が肥料として働いたのか、もしくは低負荷が生育に良い影響をもたらすのか、今後の課題の一つとしたい。

6.参考文献

自然と科学技術シリーズ アレロパシー 他感物質の作用と利用
藤井 義晴 著 農文協
化学で勝負する生物たち(Ⅰ)-アレロパシーの世界- 
今村 寿明 著 裳華房
植物の香りと生物活性-その化学的特性と機能性を科学する-
谷田貝 光克 著 フレグランスジャーナル社
雑草研究 Vol. 35 (4) 362~370 (1990)
発芽・生育試験による雑草・作物からの他感作用植物の検索
藤井義晴・渋谷知子・安田環
農林水産省農業環境技術研究所
雑草研究 Vol. 47 (3) 153~160 (2002)
メヒシバ (Digitaria adscendens Henr.) の生育に及ぼす数種ハーブ類の抽出液と植物体砕片施用の影響
程岩松*・堀内孝次*・大場伸哉*
ハニーサックル(Lonicera japonica Thunb.)とアップルミント(Mentha suaveolens L.)の
アレロパシー特性を活用した雑草抑制と作物への影響
宮内俊貴※・堀内孝次
岐阜大学大学院農学研究科

7.謝辞

 本研究を遂行するに当たり、助言及び指導して下さった担当の川添先生、試料となるローズマリーを提供して下さった埼玉県立泉高等学校の岩井先生、並びに便宜を図って下さった諸先生方にこの場を借りて厚く御礼申し上げます。

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