生細胞中でのグアニン 4重鎖構造の動態と機能の解析

研究先 東京都医学総合研究所 ゲノム動態プロジェクト

目的

近年、非 B型 DNA構造の生物学的意義への関心が高まっている。その中でもグアニン 4重鎖 (G4)構造の研究が急速に進み注目を集めている。G4構造が細胞の転写や複製制御において重要な役割を果たすことが知られている。しかし、細胞内、核内で G4構造がいつ、どこで形成されているか大部分が不明である。そこで生細胞中での G4の動態、また G4に依存して形成される DNA-RNAハイブリッドの動態を Time Lapsで詳細に解析し、これらの構造の形成を制御する因子を同定することにした。

方法

G4構造に結合する BG4(G4構造に対する一本鎖ペプチド抗体)、RNA-DNA hybridに結合するが分解はしない変異型(D129A)RNaseHタンパク、それぞれに蛍光を発する Venus及び核局在を指分する NLS融合したタンパク質を作製した。これらを生細胞発現ベクター上にクローニングし、U2OS、 HCT116細胞株内で染色体の特定部位に組み込み (CRISPR-Cas9を用い AAVS1領域に導入した)、発現する細胞株を樹立した。この細胞株を用いて Time laps解析により、核内染色体上における G4構造と RNA-DNAハイブリッドの局在を観察した。これらのシグナルの細胞周期による変化、 DNA損傷シグナルなどによる変化等が両者のシグナルに及ぼす影響を観察した。

結果

HCT116、U2OSに BG4、変異型 RNaseHを組み込み発現する株の樹立に成功した。また、変異型 RNaseH が強く蛍光を発している部分が核小体であることが分かった。U2OSにおいて BG4のシグナルは細胞核全体にあることが分かった。

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