酵母 TORC1のアミノ酸応答性活性化機構における Pib2の機能解析

研究先 東京大学 分子細胞生物学研究所 高難度蛋白質立体構造解析センター 膜蛋白質解析研究分野

目的

マクロライド系化合物ラパマイシンのターゲットとして同定された TOR(target of rapamycin)は、真核生物全般に高度に保存されたプロテインキナーゼで、細胞内で TORC1、TORC2と呼ばれる独立した 2つの複合体を形成する。TORC1はアミノ酸をはじめとした栄養によって活性化され、細胞成長を促進する。TORC1経路の制御の破綻は、がんや糖尿病などの疾病と密接に関わっている。これまでの研究で、酵母 TORC1のアミノ酸による活性化は、少なくとも2つの独立した経路を介してなされており、その一方には、Pib2が必要であるということが明らかにされた。しかし、Pib2の分子機能はまだ分かっていない。よって、Pib2の機能解析を行い、Pib2がどのようにアミノ酸による TORC1の活性化に関わっているのかを明らかにすることが目的である。

方法

まず、Pib2経路欠損株及び Pib2経路のみ活性化される変異株における TORC1のアミノ酸応答性を観察した。TORC1の活性化状態の検出は、TORC1の基質である Sch9のリン酸化状態をwestern blottingで観察して行った。次に PIB2の恒常的活性化型変異体の取得を試みた。 PIB2発現プラスミドの PIB2領域に PCRの増幅時に起こるエラーを利用して変異をランダムに導入した。そのプラスミドを酵母に形質転換して、野生型 PIB2プラスミドを持っている酵母よりもラパマイシンに対して耐性を持つ酵母をスクリーニングした。また現在、 Pib2経路の活性をin vitroでモニターできる系を利用して、液胞膜に局在する分子群の中から新規 Pib2経路構成因子の探索をしている。

結果

各変異株の TORC1のアミノ酸応答性の観察の結果、Pib2はグルタミン特異的な TORC1活性化機構で機能していることがわかった。恒常的活性化型 PIB2変異体のスクリーニングにおいては、ラパマイシン耐性を付与するクローンを取得することに成功した。解析の結果、 N末端を一部欠失した PIB2は活性化型を示すことが明らかになった。

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